ncbi blast，ncbiblast引物特异性

NCIlast简介

NCI（NationalCenterforiotechnologyInformation）的LAST（asicLocalAlignmentSearchTool）是一款强大的生物信息学工具，用于在数据库中搜索序列相似性。在引物设计过程中，NCI的LAST功能中的rimer-LAST工具尤为关键，它能够帮助设计出具有高特异性的引物，从而提高CR（聚合酶链反应）的效率和准确性。

1.引物3端选择

在设计引物时，3端的序列选择至关重要。应避免选择A，最好选择T，以减少错配引发的合成效率差异。这是因为A和T的配对能力相对较强，而C和G的配对能力较弱，选择T可以降低引物错配的可能性。

2.评估引物的特异性

评估引物的特异性是设计过程中的关键步骤。rimer-LAST工具是一个非常有用的工具，它能够提供引物特异性的评估结果。在使用rimer-LAST时，应注意以下几点：

-rimer-LAST功能：rimer-LAST整合了rimer3软件和NCI的last，可以直接从last主页找到或使用以下链接进入：htt//www.nci.nlm.nih.gov/tools/rimer-last/

引物特异性验证：rimer-LAST能够设计出具有高特异性的引物，避免互补性，防止二聚体形成，从而提高CR效率。

退火温度：退火温度应根据引物长度和GC含量来计算，找到一个平衡点，让引物在合适的温度下有效结合。

3.Wordsize（单词长度）

在LAST中，默认的Wordsize为3。较大的单词长度会得到更精确的搜索结果。在设计引物时，可以根据需要调整Wordsize，以获得更准确的搜索结果。

4.Maxmatchesinaqueryrange（查询区域内的最大匹配数）

在感兴趣区域内的匹配有时会被其他区域出现。为了确保引物的特异性，可以设置Maxmatchesinaqueryrange，限制查询区域内的最大匹配数，从而提高引物的特异性。

5.从文献中查找引物

在设计引物时，可以从文献中直接查找，经过LAST验证引物特异性后直接使用。以下是在文献中查找引物的步骤：

1.打开uMed或学术搜索引擎，输入所查基因名称。

2.翻看相关文献，选定文章内的引物（Forward/Reverse）。

3.打开NCI，进入last，进行引物特异性验证。

6.rimer-LAST比对步骤

1.打开NCI，进入last，网页如下：点击上图红框标记的rimer-LAST。

2.输入引物序列，选择数据库和参数，点击“LAST”按钮。

3.分析结果，根据结果调整引物序列，直至满足特异性要求。

在引物设计过程中，使用NCI的LAST功能中的rimer-LAST工具，可以有效地提高引物的特异性和CR效率。通过以上步骤，可以设计出具有高特异性的引物，为基因克隆和CR实验提供有力支持。